Russian Federation
Russian Federation
Head of the Clinical Diagnostic Department of the Federal Center for Cardiovascular Surgery
Astrakhan, Russian Federation
Russian Federation
Russian Federation
Russian Federation
The paper presents the results of studying the functional properties of DNA aptamers during long-term storage for 5 years. The study was performed on 25 male mongrel rats, which, after the introduction of the DNA aptamer of the thrombin inhibitor 31RE with different synthesis periods, were determined by activated partial thromboplastin time (APTT) and prothrombin time (PTV). APTT and PV were deter-mined at intervals, 10, 60, 120 minutes after administration of the drug. The shelf life of the aptamer DNA from the moment of synthesis was: 1 month, 2 years, 5 years. According to the results of the study, it was found that the estimated shelf life of DNA aptamers is at least two years with a slight de-crease in activity.
DNA aptamers, storage of oligonucleotides, preservation of biological properties
Аптамеры – это короткие однонитевые олигонуклеотиды, которые обладают уникальной способностью к специфическому связыванию с целевыми молекулами аналогично антителам с антигеном. Эти олигонуклеотиды представляют собой перспективный инструмент в различных областях биологии и медицины, включая лабораторную диагностику, таргетную терапию и биотехнологию
[1–7]. Важным этапом стало изучение функциональных свойств ДНК аптамеров in vivo. К этой группе относятся и ДНК аптамеры ингибиторы тромбина [8–11].
Однако практическое использование аптамеров требует не только наличия их способности к специфическому связыванию с целевыми молекулами, но и промышленного потенциала к использованию в качестве лекарственных или диагностических препаратов. Сохранение стабильности структуры и, следовательно, функциональных свойств аптамеров является ключевым аспектом исследований, направленных на оптимизацию их практического применения. Если аптамеры не могут сохранить функциональность в течение длительного периода хранения, их эффективность может быть существенно снижена или даже полностью потеряна. Для повышения стабильности аптамера ингибитора тромбина 31RE при хранении и для удлинения времени элиминации из организма был сконструирован его комплекс c протамином [12].
Изучение стабильности аптамеров при хранении позволяет определить оптимальные условия максимального срока годности для практического применения в научных исследованиях и в практике. В настоящее время для удлинения срока хранения аптамеров используются различные подходы и стратегии, включая использование модифицированных нуклеотидов, стабилизирующих агентов, оптимизацию условий хранения, а также разработку устойчивых матриц и покрытий для защиты аптамеров от деградации [13–16]. Уже существуют несколько препаратов на основе аптамеров, которые прошли клинические испытания и реализуются на рынке. Например, один из таких препаратов – Pegaptanib (Macugen) – был разработан для лечения возрастной макулярной дегенерации (AMD) [17–18]. Pegaptanib предназначен для ингибирования действия сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), который играет ключевую роль в развитии неоваскулярной (влажной) формы AMD, при которой происходит образование патологических кровеносных сосудов в макуле, приводящее к кровотечениям и отеку с повреждением зрительных клеток и ухудшением зрения. При разработке вышеупомянутого препарата для достижения длительного хранения были применены несколько подходов:
- Модификация нуклеотидов: введение химически модифицированных нуклеотидов, повышающих стабильность препарата. Некоторые из модификаций включают в себя замены нуклеотидов на модифицированные аналоги, добавление фосфоротиоата или группы метилирования, а также использование вторичных структурных элементов, таких как петли или стебли, для защиты аптамера от нуклеазной деградации.
- Упаковка и хранение: аптамеры могут быть сохранены в замороженном состоянии при низких температурах для предотвращения их разрушения. Часто они хранятся при температуре -20° C и ниже. При таком условии их стабильность может быть обеспечена на протяжении длительного времени.
Цель: изучить стабильность ДНК аптамера ингибитора тромбина по его функциональным свойствам при длительном хранении (на протяжении 5 лет) в эксперименте на лабораторных животных.
Материалы и методы исследования. Экспериментальное исследование, выполнявшееся в течение 5 лет, было проведено на 36 белых беспородных крысах-самцах (9 особей вошли в контрольную группу, 27 крыс – в экспериментальную) для изучения свойств ДНК аптамера в три эксперимента:
- 1 эксперимент – изучение активности ДНК аптамера через 1 месяц после синтеза;
- 2 эксперимент – изучение активности ДНК аптамера через 2 года после синтеза;
- 3 эксперимент – изучение активности ДНК аптамера через 5 лет после синтеза;
В каждом эксперименте животных разделяли на 4 группы:
- 1 группа – контрольная без введения аптамера (3 особи);
- 2 группа – опытная I с забором крови через 10 мин после введения аптамера (3 особи);
- 3 группа – опытная II с забором крови через 60 мин после введения аптамера (3 особи);
- 4 группа – опытная III с забором крови через 120 мин после введения аптамера (3 особи).
Животных содержали на базе экспериментально-биологической клиники (виварий) ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России. Физиологические параметры животных до начала исследования: возраст 6 месяцев; масса 252,91 ± 14,47 г; температура тела 37,2 ± 0,1° С. Все манипуляции с экспериментальными животными проводили согласно принципам Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Договор принят в Страсбурге 18 марта 1986 г.).
Объектом исследования стал аптамер ингибитор тромбина c шифром 31RE (длина цепи 31 нуклеотид, очищен с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ЗАО «Синтол», Москва), обладающий характеристиками, показанными в таблице 1.
Таблица 1. Паспортные характеристики аптамера 31RE
Table 1. Passport characteristics of aptamer 31RE
|
5’-3’ последовательность |
Кол-во ОЕ |
Концентрация |
Молекулярная масса, Da |
||
|
ОЕ/ мл |
пкмоль/ мкл |
мкг/ мл |
|||
|
gtg-acg-tag-gtt-ggt-gtg-gtt-ggg-gcg-tca-c |
110 |
33,6 |
100 |
977 |
9772 |
Хранение аптамеров осуществляли в морозильном ларе ЛН-300 при температуре 25 ± 1,5°С на протяжении 5 лет с измерением биологической активности через 1 месяц, 2 года и 5 лет с момента синтеза. Функциональную активность, зависящую от стабильности аптамера ингибитора тромбина 31RE при длительном хранении (2 года и 5 лет), определяли по показателям свертывания крови: протромбиновому времени (ПТВ) и активированному частичному тромбопластиновому времени (АЧТВ) в эксперименте in vivo на лабораторных животных.
Взятие крови для исследования показателей коагуляционного гемостаза выполняли под эфирным наркозом из хвостовой вены лабораторных крыс в вакуумные одноразовые полипропиленовые пробирки с 3,2 % цитратом натрия («Sarsted», Германия) и анализировали на автоматических анализаторах.
Определение ПТВ, АЧТВ в плазме крови проводили на автоматических коагулометрах «Sta Compact» («Stago Diagnostica», Франция) и «ACL 9000» («Instrumentation Laboratory», США).
ПТВ (с) и АЧТВ (с) определяли с помощью клоттингового метода. Плазму, полученную из образца крови, разбавляли стандартным раствором тромбопластина. Разведение плазмы позволяет создать оптимальные условия для свертывания крови и измерения времени свертывания. В разведенную плазму добавляли коагулянтный реагент, содержащий кальций, для инициации каскада реакций свертывания крови, включая активацию факторов свертывания и образование тромбина. После добавления коагулянтного реагента и инициации свертывания запускается таймер, отсчитывающий время с момента добавления реагента до образования стабильного тромба в автоматическом режиме.
Полученные значения ПТВ и АЧТВ сравнивали с контролем. Контрольный образец плазмы с известными ПТВ и АЧТВ используется для калибровки и оценки точности анализа. Значения этих показателей автоматически рассчитываются по калибровочному графику.
Изучение в эксперименте на лабораторных животных стабильности ДНК аптамера ингибитора тромбина 31RE по его биологическому эффекту при длительном хранении осуществляли по алгоритму, показанному на рисунке 1.
Рис. 1. Дизайн исследования
Fig. 1. Research design
Результаты исследования и их обсуждение. Раствор аптамера 31RE в дозе 1,5 мкг/кг вводили внутрибрюшинно трем группам лабораторных животных в зависимости от длительности хранения с момента синтеза: 1 группа – 1 месяц (n = 5), 2 группа – 2 года (n = 5), 3 группа – 5 лет (n = 5).
Исследовали функциональные свойства образцов ДНК аптамера ингибитора тромбина 31RE, хранившихся 5 лет, 2 года и синтезированного 1 месяц назад с интервалами в 10, 60 и 120 мин после введения препаратов. В качестве показателей коагуляционного гемостаза определяли АЧТВ и ПТВ (табл. 2).
Таблица 2. Показатели гемостаза после введения ДНК аптамера ингибитора
тромбина в зависимости от срока хранения (M ± m)
Table 2. Hemostasis parameters after administration of the thrombin inhibitor DNA aptamer depending
on the shelf life (M ± m)
|
Аптамер 31RE, срок хранения: |
Интервалы определения активности с момента введения аптамера 31RE |
|||
|
Контроль |
10 мин |
60 мин |
120 мин |
|
|
АЧТВ (с) |
||||
|
1 месяц |
19,7 ± 0,9 |
29,2 ± 1,2 |
28,9 ± 1,0 |
24,5 ± 1,4 |
|
2 года |
17,1 ± 0,5 |
25,2 ± 1,3 |
27,6 ± 1,5 |
19,0 ± 0,8 |
|
5 лет |
20,6 ± 0,8 |
18,2 ± 1,1 |
19,4 ± 2,1 |
16,9 ± 2,3 |
|
ПТВ (с) |
||||
|
1 месяц |
19,6 ± 0,8 |
27,3 ± 1,3 |
26,7 ± 1,0 |
21,3 ± 0,8 |
|
2 года |
18,8 ± 2,2 |
22,3 ± 0,7 |
28,4 ± 1,1 |
18,1 ± 1,3 |
|
5 лет |
18,2 ± 0,3 |
20,1 ± 1,4 |
18,6 ± 1,2 |
17,4 ± 0,8 |
Показатели АЧТВ сохраняются приблизительно на одном уровне на протяжении 2 лет, что, в свою очередь, подтверждает сохранность структуры молекулы аптамера и, соответственно, его функциональной активности (рис. 2). Причем определение активности ДНК аптамера ингибитора тромбина 31RE в динамике при хранении не больше 1 месяца и в течение 2 лет регистрирует максимальные значения с 10 до 60 мин. Через 5 лет значения во всех временных точках незначительно отличаются от контрольного, находясь в пределах ошибки метода.
Рис. 2. Показатели времени АЧТВ по отношению к контролю
в динамике на трех периодах хранения
Fig. 2. Indicators of the APTT time in relation to the control
in dynamics over three storage periods
Полученные данные по ПТВ свидетельствуют о том, что количественные показатели внешнего пути свертывания крови сохраняют высокие значения и указывают на стабильность структуры так же, как и в случае с АЧТВ – показателем внутреннего пути свертывания – при хранении аптамера на протяжении 2 лет (рис. 3).
Рис. 3. Показатели времени ПТВ по отношению к контролю
в динамике на трех периодах хранения
Fig. 3. Indicators of the PTV time in relation to the control
in dynamics for three storage periods
Наряду с этим показатели обоих глобальных тестов, отражающих активацию по внешнему и внутреннему пути свертывания крови, указывают на незначительную разницу во времени максимальной активности аптамера ингибитора тромбина: через 2 года хранения максимальная активность проявляется позже, к 60 мин, по сравнению с активностью препарата, используемого через 1 месяц после его синтеза.
Выводы:
- По результатам исследования срок действия изученного ДНК аптамера составляет минимум 2 года с незначительным снижением функциональной активности.
- Поскольку активность препарата через 5 лет резко снижена, следует уточнить его свойства в интервале между 2–3 и 3–4 годами.
- Подтверждение полученных предварительных данных позволит ускорить продвижение ДНК аптамеров ингибиторов тромбина в практическую медицину в качестве антикоагулянтов нового поколения.
